La investigación involucrada en el campo de la oftalmología, especialmente cuando se centra en las pruebas y en el desarrollo de productos sanitarios o procedimientos médicos que pueden tener un impacto en la salud del endotelio corneal, requiere una gran cantidad de investigaciones, que a veces tienen que enfrentar algunas dificultades técnicas.

Como ejemplo, el uso de córneas de donantes para fines de investigación no es ético, ya que son necesarias para el trasplante Afortunadamente, algunos modelos animales, como el ojo porcino, tienen propiedades anatómicas y fisiológicas bastante similares al ojo humano y, por lo tanto, son alternativas útiles a los tejidos donantes para realizar valiosas investigaciones.

Otra cuestión importante está relacionada con el método utilizado para recopilar y analizar todos los datos de imágenes cualitativas y cuantitativas. En Europa, el método más común para evaluar la viabilidad del endotelio corneal se basa en la tinción con azul de tripano y la evaluación visual de las zonas de mortalidad mediante microscopía óptica. Sin embargo, este método se realiza manualmente y, por lo tanto, la variabilidad del análisis de datos dependiente del operador puede ser un problema, especialmente cuando se considera el número cada vez mayor de análisis que se realizarán.

Para superar este problema, el equipo de I+D de Alchimia desarrolló un método estandarizado para el análisis cuantitativo de la mortalidad de las células endoteliales con una tecnología de microscopía semiautomática a través del software Fiji ImageJ, diseñado específicamente para ayudar a los investigadores en el análisis de las imágenes biológicas.

El primer paso de este método es la preparación del botón corneal del globo ocular porcino y la tinción del endotelio corneal con el azul de tripano. Posteriormente, el tejido teñido se mantiene bajo el microscopio óptico y se analiza utilizando el aumento más apropiado. En esta fase, una cámara conectada con el microscopio puede tomar una serie de imágenes del endotelio corneal. Estas imágenes luego se “transfieren” al software Fiji ImageJ que, mediante el uso de técnicas especiales para optimizar las imágenes corneales (por ejemplo, el endotelio corneal no es un tejido homogéneo y plano), puede emitir imágenes claras del área central central de 8 mm (que corresponde al botón corneal generalmente trasplantado). Dentro de esta área, el software detecta la presencia del píxel azul, correspondiente a las células muertas, y calcula el porcentaje de mortalidad de las células endoteliales en comparación con la cantidad total de células endoteliales.

Este método fue validado utilizando controles negativos (tejidos corneales sanos) y positivos (tejidos corneales muy dañados por sustancias tóxicas).

En conclusión, este sistema cuantitativo semiautomático para la medición de la mortalidad por EC corneal resultó efectivo, estandarizado y reproducible.

Para nosotros, esto significa una herramienta sencilla para realizar un primer examen de los tejidos corneales para comparar diferentes condiciones de conservación corneal y la investigación experimental sobre los tejidos corneales. Además, cuando se usa en productos ya disponibles comercialmente, este método también servirá como una evaluación de seguridad posterior a la comercialización.

Referencias:

• Giurgola L. et al. Development of a quantitative method to determine corneal endothelial cell mortality. Presentation at the European Associations of Tissue Banks (EATB), 2018
• Wenzel DA et al. A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons. J Vis Exp 2019;152.
• Guduric-Fuchs J et al. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis 2009; 15:1915:1928

Es bien sabido que el trasplante de córnea todavía está asociado con un cierto riesgo, aunque bastante bajo, de infección posterior a la queratoplastia que puede representar serias amenazas para el paciente trasplantado. Dado que una de las posibles causas incluye el injerto de tejido donante contaminado, los bancos de ojos tienen la responsabilidad de asegurarse de que sólo córneas libres de contaminación se distribuyan para el trasplante.

Con este objetivo, los laboratorios de I+D de Alchilife tienen una colaboración continua con el Banco de Ojos de Monza para seleccionar y validar un sistema para confirmar la esterilidad de las córneas mediante la prueba de todos los medios que se utilizan para preservar y transportar los tejidos donantes.

Como sabemos, la mayoría de los bancos de ojos europeos conservan las córneas donantes a 31°C en medios de cultivo de órganos que permiten preservar los tejidos donantes durante hasta 4 semanas. Este tiempo de conservación más largo le da a los operadores de bancos de ojos la facilidad para realizar todas las pruebas precisas en tejidos donantes.

Los medios de conservación de la córnea disponibles en el mercado contienen una mezcla de agentes antimicrobianos. Por un lado, estos agentes ayudan a minimizar la contaminación en las córneas preservadas, pero por el otro, pueden prevenir el crecimiento de algunos microorganismos cuya presencia podría no revelarse durante el análisis microbiológico y, como consecuencia, transferirse al paciente trasplantado.

Esta es la razón por la cual la “Prueba de idoneidad del método” de la Farmacopea Europea (EP) recomienda eliminar todos los factores que pueden interferir con el crecimiento microbiano antes de las pruebas microbiológicas.

El mismo Banco de Ojos de Monza usualmente realizaba las pruebas microbiológicas usando el sistema automático BACTEC™ (Becton Dickinson), a través del cual las muestras de medios de preservación se analizan usando botellas BACTEC™ específicas que contienen resinas que deberían mantener los residuos antimicrobianos. A pesar del uso de un sistema automático, se ha demostrado que a veces los resultados obtenidos pueden ser engañosos.

Para evitar resultados falsos negativos, el nuevo método estudiado incluye un paso adicional en el que todos los medios a analizar se tratan con un product sanitaria patentado similar a una jeringa, con marcado CE, RESEP (Alchimia Srl), que también contiene una mezcla especial de resinas para la eliminación total de los agentes antimicrobianos de los medios de conservación de la córnea.

Este método fue validado utilizando muestras de medio de cultivo de órganos (Tissue-C, Alchimia Srl) y medio de deshinchazón/transporte (Carry-C, Alchimia Srl) a través del inóculo con varias cepas microbianas de referencia EP antes de la transferencia a las botellas BACTEC™ para el análisis automático. Por supuesto, también se usaron controles negativos (es decir, muestras sin cepas microbianas) y controles positivos (es decir, muestras con cepas microbianas).

Los resultados obtenidos mostraron que el uso de RESEP aumentó la sensibilidad de la prueba de esterilidad utilizando el sistema automatizado BACTEC™ hasta un 100% y, en consecuencia, permitió la validación del método para la prueba de esterilidad de los medios de conservación y deshinchazón/transporte de la cornea según los requerimientos de EP.

References:

• Vignola R. et al. Validation of the BD BACTEC™ method for sterility testing of corneal preservation media according to the European Pharmacopoeia (chapter 2.6.1.). Presentations at the European Association of Tissue Banks EATB 2017 and 2018
• Vignola et al. A two-centre validation study of sterility test of corneal storage media with elimination of interfering antimicrobials in compliance with the European Pharmacopoeia. Cell Tissue Bank 2019 https://doi.org/10.1007/s10561-019-09766-7
• Council of Europe (2013a) Sterility test. In: European Directorate For The Quality of Medicines and Healthcare (ed) European Pharmacopoeia, Eight edn, Vol I, Strasbourg Cedex, France, pp 175–178
• Schroeter J. et al. Validation of the microbiological testing of tissue preparations using the BACTECTM blood culture system. Transfus Med Hemother 2012;39(6):387–390
• Mistò R. et al. Method for sterility testing of corneal storage and transport media after removal of interfering antimicrobials: prospective validation study in compliance with the European Pharmacopoeia. BMJ Open Ophthalmol 2017;2(1): e000093.

Durante los procedimientos vitreorretinianos, la visualización de estructuras transparentes como la corteza del vítreo, ERM y ILM puede ser un desafío; sin embargo, la tinción adecuada de estos tejidos puede aumentar la eficiencia de una eliminación no traumática.

La cirugía vitreorretiniana ha evolucionado rápidamente en los últimos 10 años mediante el desarrollo de nuevas técnicas y la mejora en las máquinas de vitrectomía. Además, se ha dedicado un gran esfuerzo a la formulación de colorantes vitales para mejorar la visualización de los tejidos y facilitar el peeling de las membranas: esto conduce a una gran reducción de complicaciones como roturas iatrogénicas, daños en la retina y, finalmente, mínimas molestias postoperatorias para los pacientes.

Para garantizar todo esto, el colorante para el segmento posterior del ojo debe cumplir algunos requisitos importantes. En primer lugar, tiene que ser lo suficientemente denso como para acostarse fácilmente y extenderse sobre la membrana sin causar ningún daño debido al peso excesivo. De ello se deduce que tiene que adherirse selectivamente y teñir las membranas oculares del segmento posterior mientras que es soluble en agua para ser fácilmente lavable de los tejidos al final de la cirugía. Por último, y lo más importante, el colorante vital no debe ser tóxico para los tejidos oculares.

En las últimas décadas ha surgido fuertemente el tema de la seguridad de los tintes vitales.

Por ejemplo, el verde de indocianina ha sido abandonado, debido a las preocupaciones de toxicidad in vitro e in-vivo. En su lugar, las formulaciones a base de color azul tripán adaptadas para su uso en la cirugía ocular del segmento posterior se consideran seguras y actualmente se consideran por unanimidad el tratamiento de referencia para la cirugía de ERM.

En nuestros laboratorios de investigación, el método de elección para probar la seguridad de los colorantes vitales para la cirugía del segmento ocular posterior siempre ha sido una prueba de citotoxicidad in vitro validada cuantitativa y cualitativamente por método de contacto directo según ISO 10993-5.

Este método de prueba tiene las siguientes ventajas:

• es altamente sensible y capaz de detectar incluso citotoxicidad débil;
• se realiza no sólo en el fibroblasto de ratón BALB 3T3 sino también en la línea celular ARPE-19 derivada de la retina humana: de esta manera, es posible cumplir con las recomendaciones de las normas ISO que establecen que el método de ensayo de citotoxicidad in vitro de un producto para uso humano debe seleccionarse para representar, en la medida de lo posible, la situación en la que se va a utilizar el producto;
• aunque durante la cirugía el colorante debe permanecer en contacto con los tejidos oculares durante un tiempo muy corto (generalmente pocos segundos), la prueba de citotoxicidad del producto de ensayo se realiza durante un tiempo de contacto de hasta 24 horas.

Referencias:

• Mariotti C. et al. Negative staining of the vitreous with the use of vital dyes. Eur J Pharmacol 2018;28(1):117-118
• Iuliano L. et al. Idiopathic epiretinal membrane surgery: safety, efficacy and patient-related outcomes. Clin Ophthalmol 2019; 13:1253:1265
• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:en

En los Estados Unidos de América, los tejidos corneales de donantes se conservan en líquidos de conservación en frío que no contienen antimicóticos, y se someten a procesamiento de tejidos para las nuevas técnicas lamelares tan pronto como sea posible después de la adquisición de tejidos; por lo tanto, en caso de infecciones derivadas de donantes en los receptores, la única opción es el tratamiento del paciente trasplantado.

Si la tendencia creciente de infección fúngica post-queratoplastia durante los últimos años en los EE.UU. podría deberse a la ausencia de agentes antimicóticos en los medios fríos o a una infiltración más fácil de organismos infecciosos en los interespacios lamelares durante el procesamiento de tejidos, la posibilidad de complementar los medios de almacenamiento en frío con agentes antimicóticos está atrayendo cada vez más atención como una posible solución para aumentar la seguridad de los receptores.

Un reciente estudio in vitro de time-kill realizado por el equipo de I+D de Alchilife sobre un nuevo medio que contiene Anfotericina B (2,5 g/ml) y destinado a la conservación en frío de córneas explantadas demostró la eficacia antimicótica del medio – a pesar de la baja temperatura – frente a cepas fúngicas comúnmente asociadas con queratitis y endoftalmitis, incluyendo C. albicans, C. glabrata, y C. tropicalis.

Paralelamente al estudio de time-kill, también se determinó la concentración mínima de inhibitoria de Anfotericina B (MIC) para estas cepas de Candida. Mediante el uso de las tiras Etest que contienen una concentración de anfotericina B que varía de 0,002 a 32 g/ml que se colocó sobre cada cepa de levadura, cultivadas individualmente en placas de agar, durante 24 y 48 horas, se encontró que los MIC varían entre 0,25 y > 1 g/ml.

Estos resultados sugirieron que las diferencias en la curvas de letalidad entre las cepas pueden corresponder a la diferente susceptibilidad a la Anfotericina B según los MIC; no menos importante, también confirmaron la buena eficacia antifúngica de la Anfotericina B en el nuevo producto para la conservación en frío, ya que la concentración de 2,5 g/ml está muy por encima de los valores tan determinados de MIC.

	MIC (1 µg/ml)
C. Parapsilosis ATCC 90018	0,25-0,38
C. Albicans UCL	≥ 1
C. Albicans ATCC 10231	0,19-0,25
C. Glabrata BPEI	0,5
C. Albicans ATCC MYA 2876	0,25
C. Tropicalis ATCC 750	0,38
C. Albicans ATCC 90028	0,25

Referencias::

• Aldave AJ et al. Report of the Eye Bank Association of America medical advisory board subcommittee on fungal infection after corneal transplantation. Cornea 2013; 32:149–154
• Giurgola L. et al. Antimycotic efficacy and safety of a new cold corneal storage medium by time-kill and toxicity studies. Cornea 2019; 38(19):1413-1321.
• Fontana L. et al. Interface infectious keratitis after anterior and posterior lamellar keratoplasty. Clinical features and treatment strategies. A review. Br J Ophthalmol 2018; 0:1–8

Cuando la visualización de la cápsula anterior se ve comprometida debido a un reflejo rojo ausente o insuficiente, como en el caso de cataratas maduras, cataratas corticales densas, cataratas subcapsulares posteriores densas u ojos con hialosis asteroide densa, hay un cierto riesgo de rotura capsular anterior extendiéndose a la periferia, con una predisposición posterior a la ruptura de la cápsula posterior, pérdida del vítreo y luxación posterior del núcleo.

La tinción de la cápsula anterior con azul de tripano (TB), realizada por primera vez por Melles et al. en 1999, ayuda a los cirujanos a completar la capsulorrexis en estas situaciones difíciles.

Una pequeña concentración de colorante TB como 0.05% puede proporcionar una buena tinción de la cápsula anterior, y la toxicidad endotelial comúnmente se considera insignificante cuando el colorante TB se usa en baja concentración.

Sin embargo, para garantizar la máxima seguridad del paciente, siempre debe determinarse la biocompatibilidad, y la determinación de la citotoxicidad es parte del proceso de evaluación inicial según la norma ISO.

La búsqueda de los métodos de prueba de biocompatibilidad y citotoxicidad verdaderamente confiables siempre ha sido una de las principales misiones de Alchilife. Esta es la razón por la cual la prueba de citotoxicidad in vitro por método de contacto directo según ISO 10993-5, que es altamente sensible y capaz de detectar incluso la citotoxicidad débil, siempre ha sido el método de elección utilizado en nuestros laboratorios de investigación.

Utilizando este enfoque, el departamento de I+D de Alchimia validó cuantitativa y cualitativamente la prueba de citotoxicidad de los colorantes vitales del segmento anterior según la norma ISO 10993-5. Al usar sólo 30 µl del colorante aplicado en las líneas celulares ARPE19 y BALB 3T3 durante 24 horas, se puede determinar de manera fácil y confiable la ausencia o la presencia de citotoxicidad en todo tipo de colorantes TB.

Un aspecto de los métodos para la prueba de citotoxicidad adoptados por nuestro departamento de I+D merece especial atención, ya que permite “ultra garantizar” la seguridad de los colorantes TB que se utilizarán durante las cirugías del segmento anterior: se eligió realizar el ensayo de citotoxicidad no sólo en fibroblastos murinos BALB 3T3, sino también en la línea celular epitelial de pigmento retiniano humano ARPE19.

Esta es nuestra forma de asegurar de que los colorantes TB sean seguros incluso en caso de tinción accidental del vítreo durante la cirugía de cataratas, un evento que puede, aunque no con frecuencia, ocurrir durante la cirugía del segmento anterior.

Referencias:

• Parkash et al. Modified 30 G needle trypan blue staining technique under air for a uniform and consistent anterior capsule staining. Clin Ophthalmol 2017; 11:1651-1659
• Melles GRI et al. Trypan blue capsule staining of visualize the capsulorhexis in cataract surgery. J Cataract Refract Surg 1999; 25:7-9
• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:en
• Coelho RP. Inadvertent vitreous staining by trypan blue during phacoemulsification. Vis Pan-Am 2016; 15:26-27.
• Gaur A. Inadvertent vitreous staining. J Cataract Refract Surg 2005; 31:649.

Las nuevas técnicas lamelares para la sustitución selectiva de capas enfermas de la córnea, que ahora se prefieren en gran medida sobre la queratoplastia penetrante, se han relacionado, al menos en cierta medida, con una tendencia creciente de infección fúngica post queratoplastia en los EE.UU. Se han sugerido dos factores como factores de riesgo: en primer lugar, estas técnicas podrían mejorar la infiltración de organismos infecciosos en el espacio inter-lamelar y en segundo lugar, pero no menos importante, los medios de conservación en frío comúnmente utilizados en los Estados Unidos no contienen agentes antimicóticos.

Recientemente, nuestro equipo de I+D ha concluido los estudios para evaluar la curva de letalidad in vitro de Kerasave contra varias especies de Candida comúnmente asociadas con queratitis y endoftalmitis, incluyendo C. albicans, C. glabrata, y C. tropicalis.

Kerasave, un nuevo medio de almacenamiento desarrollado por Alchimia Srl (Italia), que se suministra con un comprimido de amphotericina B que se añadirá al medio antes de su uso (dando así una concentración final de 2,5 g/ml), está destinado a la conservación de córneas de donantes a 4°C durante un máximo de 14 días.

Kerasave mostró una alta eficacia antifúngica contra cepas fúngicas susceptibles a 4°C, en particular contra C. albicans y C. tropicalis. Ya dentro de los 5 días posteriores a la incubación, cuatro de las seis cepas contaminadas con 10 UFC/ml demostraron una reducción significativa de ≥ 3 Log10 en promedio en comparación con los controles (p < 0.01).

La utilidad de añadir un agente antimicótico a los medios de conservación en frío aun es objeto de debate en los EE. UU., principalmente debido a algunas preocupaciones sobre cuestiones de eficacia y seguridad. Los resultados de este estudio pueden ayudar a disipar dudas, tales como:

• para obtener resultados verdaderamente fiables sobre la eficacia antimicótica, todas las muestras líquidas antes de la siembra fueron tratadas con RESEP (Alchimia Srl), un dispositivo en jeringa, patentado y con marcado CE, que contiene una mezcla de resinas para la eliminación de antimicrobianos de las muestras y para evitar resultados falsos negativos durante el ensayo de microbiología;
• la ausencia de citotoxicidad, irritación o sensibilización del medio Kerasave se evaluó mediante las pruebas de citotoxicidad, irritación ocular tópica y pruebas de hipersensibilidad retardada según la ISO 10993-5 y 10993-10.

Además, se debe recordar que el trasplante del injerto de donante poco después de la recuperación del tejido (como se realiza comúnmente en los EE.UU.,) no deja el tiempo para las pruebas microbiológicas antes de la cirugía; en caso de infección post queratoplastia, la única opción es el tratamiento del receptor.

Por lo tanto, los resultados de los estudios de las curvas de letalidad añaden más datos a favor de la seguridad antimicótica y de la eficacia y seguridad de la suplementación de medios de conservación en frío de la córnea con anfotericina B.

Referencias:

• Giurgola l. et al. Antimycotic efficacy and safety of a new cold corneal storage medium by time-kill and toxicity studies. Cornea 2019, July 22, publish ahead of print.Skenderi Z. et al.
• Increased sensitivity of microbiological testing of cornea organ culture medium by additional resin treatment.BMJ Open Ophthalmol. 2018;3:e000173
• Fontana L. et al. Interface infectious keratitis after anterior and posterior lamellar keratoplasty. Clinical features and treatment strategies. A review. Br J Ophthalmol. 2018; 0:1–8.
• ISO 10993-5:2009 biological evaluation of medical devices part 5: tests for in vitro cytotoxicity. Available at: https://www.iso.org/obp/ui/ #iso:std:iso:10993:-5:en. Accessed July 6, 2019.
• ISO 10993-10:2010 biological evaluation of medical devices part 10: tests for irritation and skin sensitization. August 1, 2018. Available at: https://www.iso.org/obp/ui/”\l”iso:std:iso:10993:-10:ed-3:v1:en. Ac- cessed July 6, 2019