Durante los procedimientos vitreorretinianos, la visualización de estructuras transparentes como la corteza del vítreo, ERM y ILM puede ser un desafío; sin embargo, la tinción adecuada de estos tejidos puede aumentar la eficiencia de una eliminación no traumática.

La cirugía vitreorretiniana ha evolucionado rápidamente en los últimos 10 años mediante el desarrollo de nuevas técnicas y la mejora en las máquinas de vitrectomía. Además, se ha dedicado un gran esfuerzo a la formulación de colorantes vitales para mejorar la visualización de los tejidos y facilitar el peeling de las membranas: esto conduce a una gran reducción de complicaciones como roturas iatrogénicas, daños en la retina y, finalmente, mínimas molestias postoperatorias para los pacientes.

Para garantizar todo esto, el colorante para el segmento posterior del ojo debe cumplir algunos requisitos importantes. En primer lugar, tiene que ser lo suficientemente denso como para acostarse fácilmente y extenderse sobre la membrana sin causar ningún daño debido al peso excesivo. De ello se deduce que tiene que adherirse selectivamente y teñir las membranas oculares del segmento posterior mientras que es soluble en agua para ser fácilmente lavable de los tejidos al final de la cirugía. Por último, y lo más importante, el colorante vital no debe ser tóxico para los tejidos oculares.

En las últimas décadas ha surgido fuertemente el tema de la seguridad de los tintes vitales.

Por ejemplo, el verde de indocianina ha sido abandonado, debido a las preocupaciones de toxicidad in vitro e in-vivo. En su lugar, las formulaciones a base de color azul tripán adaptadas para su uso en la cirugía ocular del segmento posterior se consideran seguras y actualmente se consideran por unanimidad el tratamiento de referencia para la cirugía de ERM.

En nuestros laboratorios de investigación, el método de elección para probar la seguridad de los colorantes vitales para la cirugía del segmento ocular posterior siempre ha sido una prueba de citotoxicidad in vitro validada cuantitativa y cualitativamente por método de contacto directo según ISO 10993-5.

Este método de prueba tiene las siguientes ventajas:

• es altamente sensible y capaz de detectar incluso citotoxicidad débil;
• se realiza no sólo en el fibroblasto de ratón BALB 3T3 sino también en la línea celular ARPE-19 derivada de la retina humana: de esta manera, es posible cumplir con las recomendaciones de las normas ISO que establecen que el método de ensayo de citotoxicidad in vitro de un producto para uso humano debe seleccionarse para representar, en la medida de lo posible, la situación en la que se va a utilizar el producto;
• aunque durante la cirugía el colorante debe permanecer en contacto con los tejidos oculares durante un tiempo muy corto (generalmente pocos segundos), la prueba de citotoxicidad del producto de ensayo se realiza durante un tiempo de contacto de hasta 24 horas.

Referencias:

• Mariotti C. et al. Negative staining of the vitreous with the use of vital dyes. Eur J Pharmacol 2018;28(1):117-118
• Iuliano L. et al. Idiopathic epiretinal membrane surgery: safety, efficacy and patient-related outcomes. Clin Ophthalmol 2019; 13:1253:1265
• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:en

En los Estados Unidos de América, los tejidos corneales de donantes se conservan en líquidos de conservación en frío que no contienen antimicóticos, y se someten a procesamiento de tejidos para las nuevas técnicas lamelares tan pronto como sea posible después de la adquisición de tejidos; por lo tanto, en caso de infecciones derivadas de donantes en los receptores, la única opción es el tratamiento del paciente trasplantado.

Si la tendencia creciente de infección fúngica post-queratoplastia durante los últimos años en los EE.UU. podría deberse a la ausencia de agentes antimicóticos en los medios fríos o a una infiltración más fácil de organismos infecciosos en los interespacios lamelares durante el procesamiento de tejidos, la posibilidad de complementar los medios de almacenamiento en frío con agentes antimicóticos está atrayendo cada vez más atención como una posible solución para aumentar la seguridad de los receptores.

Un reciente estudio in vitro de time-kill realizado por el equipo de I+D de Alchilife sobre un nuevo medio que contiene Anfotericina B (2,5 g/ml) y destinado a la conservación en frío de córneas explantadas demostró la eficacia antimicótica del medio – a pesar de la baja temperatura – frente a cepas fúngicas comúnmente asociadas con queratitis y endoftalmitis, incluyendo C. albicans, C. glabrata, y C. tropicalis.

Paralelamente al estudio de time-kill, también se determinó la concentración mínima de inhibitoria de Anfotericina B (MIC) para estas cepas de Candida. Mediante el uso de las tiras Etest que contienen una concentración de anfotericina B que varía de 0,002 a 32 g/ml que se colocó sobre cada cepa de levadura, cultivadas individualmente en placas de agar, durante 24 y 48 horas, se encontró que los MIC varían entre 0,25 y > 1 g/ml.

Estos resultados sugirieron que las diferencias en la curvas de letalidad entre las cepas pueden corresponder a la diferente susceptibilidad a la Anfotericina B según los MIC; no menos importante, también confirmaron la buena eficacia antifúngica de la Anfotericina B en el nuevo producto para la conservación en frío, ya que la concentración de 2,5 g/ml está muy por encima de los valores tan determinados de MIC.

	MIC (1 µg/ml)
C. Parapsilosis ATCC 90018	0,25-0,38
C. Albicans UCL	≥ 1
C. Albicans ATCC 10231	0,19-0,25
C. Glabrata BPEI	0,5
C. Albicans ATCC MYA 2876	0,25
C. Tropicalis ATCC 750	0,38
C. Albicans ATCC 90028	0,25

Referencias::

• Aldave AJ et al. Report of the Eye Bank Association of America medical advisory board subcommittee on fungal infection after corneal transplantation. Cornea 2013; 32:149–154
• Giurgola L. et al. Antimycotic efficacy and safety of a new cold corneal storage medium by time-kill and toxicity studies. Cornea 2019; 38(19):1413-1321.
• Fontana L. et al. Interface infectious keratitis after anterior and posterior lamellar keratoplasty. Clinical features and treatment strategies. A review. Br J Ophthalmol 2018; 0:1–8

Las nuevas técnicas lamelares para la sustitución selectiva de capas enfermas de la córnea, que ahora se prefieren en gran medida sobre la queratoplastia penetrante, se han relacionado, al menos en cierta medida, con una tendencia creciente de infección fúngica post queratoplastia en los EE.UU. Se han sugerido dos factores como factores de riesgo: en primer lugar, estas técnicas podrían mejorar la infiltración de organismos infecciosos en el espacio inter-lamelar y en segundo lugar, pero no menos importante, los medios de conservación en frío comúnmente utilizados en los Estados Unidos no contienen agentes antimicóticos.

Recientemente, nuestro equipo de I+D ha concluido los estudios para evaluar la curva de letalidad in vitro de Kerasave contra varias especies de Candida comúnmente asociadas con queratitis y endoftalmitis, incluyendo C. albicans, C. glabrata, y C. tropicalis.

Kerasave, un nuevo medio de almacenamiento desarrollado por Alchimia Srl (Italia), que se suministra con un comprimido de amphotericina B que se añadirá al medio antes de su uso (dando así una concentración final de 2,5 g/ml), está destinado a la conservación de córneas de donantes a 4°C durante un máximo de 14 días.

Kerasave mostró una alta eficacia antifúngica contra cepas fúngicas susceptibles a 4°C, en particular contra C. albicans y C. tropicalis. Ya dentro de los 5 días posteriores a la incubación, cuatro de las seis cepas contaminadas con 10 UFC/ml demostraron una reducción significativa de ≥ 3 Log10 en promedio en comparación con los controles (p < 0.01).

La utilidad de añadir un agente antimicótico a los medios de conservación en frío aun es objeto de debate en los EE. UU., principalmente debido a algunas preocupaciones sobre cuestiones de eficacia y seguridad. Los resultados de este estudio pueden ayudar a disipar dudas, tales como:

• para obtener resultados verdaderamente fiables sobre la eficacia antimicótica, todas las muestras líquidas antes de la siembra fueron tratadas con RESEP (Alchimia Srl), un dispositivo en jeringa, patentado y con marcado CE, que contiene una mezcla de resinas para la eliminación de antimicrobianos de las muestras y para evitar resultados falsos negativos durante el ensayo de microbiología;
• la ausencia de citotoxicidad, irritación o sensibilización del medio Kerasave se evaluó mediante las pruebas de citotoxicidad, irritación ocular tópica y pruebas de hipersensibilidad retardada según la ISO 10993-5 y 10993-10.

Además, se debe recordar que el trasplante del injerto de donante poco después de la recuperación del tejido (como se realiza comúnmente en los EE.UU.,) no deja el tiempo para las pruebas microbiológicas antes de la cirugía; en caso de infección post queratoplastia, la única opción es el tratamiento del receptor.

Por lo tanto, los resultados de los estudios de las curvas de letalidad añaden más datos a favor de la seguridad antimicótica y de la eficacia y seguridad de la suplementación de medios de conservación en frío de la córnea con anfotericina B.

Referencias:

• Giurgola l. et al. Antimycotic efficacy and safety of a new cold corneal storage medium by time-kill and toxicity studies. Cornea 2019, July 22, publish ahead of print.Skenderi Z. et al.
• Increased sensitivity of microbiological testing of cornea organ culture medium by additional resin treatment.BMJ Open Ophthalmol. 2018;3:e000173
• Fontana L. et al. Interface infectious keratitis after anterior and posterior lamellar keratoplasty. Clinical features and treatment strategies. A review. Br J Ophthalmol. 2018; 0:1–8.
• ISO 10993-5:2009 biological evaluation of medical devices part 5: tests for in vitro cytotoxicity. Available at: https://www.iso.org/obp/ui/ #iso:std:iso:10993:-5:en. Accessed July 6, 2019.
• ISO 10993-10:2010 biological evaluation of medical devices part 10: tests for irritation and skin sensitization. August 1, 2018. Available at: https://www.iso.org/obp/ui/”\l”iso:std:iso:10993:-10:ed-3:v1:en. Ac- cessed July 6, 2019

El equipo de I+D de Alchilife, en colaboración con Mario Romano, MD, es uno de los primeros laboratorios que validó un método de contacto directo para el ensayo de citotoxicidad realizado de acuerdo con la norma ISO 10993-5 sobre perfluorocarbonos (PFCL) para cirugía oftálmica.

La selección de un método verdaderamente confiable para la evaluación de la citotoxicidad de los PFLC es la estrategia clave para evitar serias preocupaciones sobre la seguridad de los pacientes. El pasado desafortunado ha demostrado que el método de “dilución de extracto”, a pesar de ser mencionado entre las pruebas aceptables por la norma ISO 10993-5, no es un ensayo confiable para productos sanitarios que contienen sustancias volátiles. Por el contrario, la prueba de contacto directo, que siempre ha sido el método de elección utilizado en los laboratorios de Alchilife, es altamente sensible, capaz de detectar incluso una citotoxicidad baja, y está ganando un mayor interés en el campo de la seguridad de los PFCL.

Al explotar las propiedades de alta densidad de los PFCL liquidos, el equipo de investigadores de Alchilife pudo garantizar el contacto directo efectivo entre el perfluorocarbono y el sustrato celular (es decir la capa celular ARPE-19 y BALB 3T3) durante toda la duración de la prueba al inyectar cuidadosamente el perfluorocarbono con la punta de la pipeta sumergida en el medio justo encima de las líneas celulares: esto crea una sola burbuja densa que se deposita suavemente en las células debido a la fuerza de la gravedad, evitando al mismo tiempo una presión excesiva en la capa celular debido al peso de la muestra. Este paso simula lo que sucede en el ojo durante el uso clínico. La burbuja densa así formada evita cualquier evaporación de muestra o pérdida de contacto del PFCL con las células. Este método permite superar el problema de la insolubilidad del PFCL en agua que evita que la muestra se diluya en el medio, y este último puede ser uno de los factores que perjudican la confiabilidad del método de extracción para probar la citotoxicidad del PFCL.

Con el enfoque de Alchilife se pueden probar con éxito varias cantidades de áreas de contacto y tiempos de contacto (hasta 24 horas). Como resultado de este estudio, cuyos resultados preliminares fueron presentados por el Dr. Romano en el 18 ° Congreso Euretina en Viena, la prueba de citotoxicidad por contacto directo de los perfluorocarbonos, que garantiza cubrir el 59% de las áreas de superficie celular durante 24 h de tiempo de contacto según la norma ISO 10993-5 fue validada cuantitativa y cualitativamente en líneas celulares ARPE19 y BALB 3T3.

Referencias:

• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.
  https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:en (accessed 20 July 2019)
• Li et al. Study on the in vitro cytotoxicity testing of medical devices(Review). Biomed Rep 2015;3(5):617-620.
• Srivastava GK et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxity evaluation. Sci Rep 2018;8(1):1425.
• Romano M. Perfluorocarbons for intraocular use: cytotoxicity test validation according to the ISO 10993-5. Presentation at Euretina 2018
• Romano MR et al. Evaluation of Cytotoxicity of Perfluorocarbons for Intraocular Use by Cytotoxicity Test In Vitro in Cell Lines and Human Donor Retina Ex Vivo. Transl Vis Sci Technol 2019; 8(5):24.

El equipo de I+D de Alchilife se dedica a ajustar pruebas de citotoxicidad verdaderamente confiables realizadas según la norma ISO 10993-5 en productos sanitarios para cirugía oftálmica, incluyendo perfluorocarbonos, colorantes para la cirugía del segmento anterior y posterior y aceites de silicona.

La desafortunada experiencia en España durante los últimos años con el uso de algunos perflurocarbonos comercializados nos ha enseñado que los compuestos de alta pureza aún pueden generar serias preocupaciones sobre la seguridad de los pacientes, ya que incluso una pequeña cantidad de impurezas residuales puede tener propiedades citotóxicas.

En nuestros laboratorios, el “método de contacto directo” según la norma ISO 10993-5 siempre ha sido el método elegido para determinar el posible riesgo toxicológico de un producto, utilizando un enfoque cuantitativo y cualitativo en las líneas celulares ARPE-19 y BALB/3T3. Sin embargo, los eventos recientes llevaron a nuestros investigadores a revisar la norma ISO 10993-5, y ahora están a punto de ajustar y validar pruebas de citotoxicidad verdaderamente confiables para verificar la seguridad de una amplia gama de produco sanitarios para uso intraocular.

Si se realizan en productos ya disponibles comercialmente, estas pruebas servirán como una evaluación de seguridad posterior a la comercialización; si se realizan en materias primas y productos en derallolo, serán útiles como herramientas de detección antes de realizar pruebas toxicológicas más extensas.

Referencias:

• Pastor et al. Acute retinal damage after using a toxic perfluoro-octane for vitreo-retinal surgery. Retina 2017;37(6):1140-1151.
• Li et al. Study on the in vitro cytotoxicity testing of medical devices(Review).
  Biomed Rep 2015;3(5):617-620.
• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.
  https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:en (accessed 16 July 2019)
• Romano M. Cytotoxicity testing according to ISO 10993-5 of perfluorocarbon manufacturing process residuals. Presentation at Euretina 2018.
• Romano MR et al. Evaluation of Cytotoxicity of Perfluorocarbons for Intraocular Use by Cytotoxicity Test In Vitro in Cell Lines and Human Donor Retina Ex Vivo. Transl Vis Sci Technol 2019; 8(5):24.