La ricerca nel campo dell’oftalmologia, specialmente quando focalizzata sui test e sullo sviluppo di dispositivi o procedure mediche che possono avere un impatto sulla salute dell’endotelio corneale, richiede un gran numero di indagini, che a volte affrontano alcune difficoltà tecniche.

Ad esempio, l’uso a scopo di ricerca di cornee espiantate da donatori non è etico, in quanto sono necessarie per il trapianto. Fortunatamente, alcuni modelli animali, come l’occhio suino, hanno proprietà anatomiche e fisiologiche abbastanza simili all’occhio umano e quindi sono valide alternative ai tessuti corneali umani per svolgere ricerche preziose.

Un’altra questione importante riguarda il metodo utilizzato per la raccolta e l’analisi di tutti i dati qualitativi e quantitativi delle immagini. In Europa, il metodo più comune per valutare la vitalità dell’endotelio corneale si basa sulla colorazione con trypan blue e sulla valutazione visiva delle zone di mortalità mediante microscopia ottica. Tuttavia, questo metodo viene eseguito manualmente e, pertanto, la variabilità dell’analisi dei dati, dipendente dall’operatore, può essere un problema, soprattutto se si considera il numero sempre crescente di analisi da eseguire.

Per ovviare a questo problema, il team di Ricerca e Sviluppo di Alchimia ha sviluppato un metodo standardizzato per l’analisi quantitativa della mortalità delle cellule endoteliali con una tecnologia di microscopia semi-automatizzata attraverso il software Fiji ImageJ, appositamente progettato per aiutare i ricercatori nell’analisi delle immagini biologiche.

La prima fase di questo metodo è la preparazione del bottone corneale dal globo oculare suino e la colorazione dell’endotelio corneale con il trypan blue. Successivamente, il tessuto colorato viene posizionato sotto al microscopio ottico e analizzato utilizzando l’ingrandimento più appropriato. A questo punto, una fotocamera collegata al microscopio può scattare una serie di immagini dell’endotelio corneale. Queste immagini vengono quindi “trasferite” al software Fiji ImageJ che, utilizzando speciali tecniche per ottimizzare le immagini corneali (ad esempio: l’endotelio corneale non è un tessuto omogeneo e piatto), può rilasciare immagini nitide dell’area centrale di 8 mm (che corrisponde al bottone corneale solitamente trapiantato). All’interno di quest’area, il software rileva la presenza di pixel blu, corrispondenti alle cellule morte, e calcola la percentuale di mortalità delle cellule endoteliali rispetto alla quantità totale di cellule endoteliali.

Questo metodo è stato validato usando controlli negativi (tessuti corneali sani) e positivi (tessuti corneali gravemente danneggiati da sostanze tossiche).

In conclusione, questo sistema quantitativo semi-automatizzato per la misurazione della mortalità corneale delle cellule endoteliali è risultato efficace, standardizzato e riproducibile.

Per noi, questo significa uno strumento semplice per eseguire un primo screening dei tessuti corneali per confrontare le diverse condizioni di conservazione corneale e la ricerca sperimentale sui tessuti corneali. Inoltre, se utilizzato su prodotti già disponibili in commercio, questo metodo servirà anche come valutazione di sicurezza post-commercializzazione.

Riferimenti:

• Giurgola L. et al. Development of a quantitative method to determine corneal endothelial cell mortality. Presentation at the European Associations of Tissue Banks (EATB), 2018
• Wenzel DA et al. A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons. J Vis Exp 2019;152.
• Guduric-Fuchs J et al. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis 2009; 15:1915:1928

È noto che il trapianto di cornea è ancora associato a un certo – sebbene piuttosto basso – rischio di infezione post-operatoria che può rappresentare una seria minaccia per il paziente trapiantato. Poiché una delle possibili cause comprende l’innesto di tessuto donatore contaminato, le banche degli occhi hanno la responsabilità di accertare che per il trapianto siano distribuite solo le cornee prive di contaminazione.

Con questo obiettivo, i laboratori di Ricerca e Sviluppo Alchilife stanno collaborando con la Banca degli Occhi di Monza per selezionare e convalidare un sistema per confermare la sterilità delle cornee testando tutti i medium utilizzati per preservare e trasportare i tessuti dei donatori.

Come sappiamo, la maggior parte delle banche degli occhi europee conserva le cornee dei donatori in medium di coltura a 31°C che consente di preservare i tessuti espiantati fino a un massimo di 4 settimane. Questo tempo di conservazione più lungo offre agli operatori delle banche degli occhi la possibilità di eseguire test accurati sui tessuti donati con maggiore facilità.

I medium per la conservazione corneale disponibili sul mercato contengono una miscela di agenti antimicrobici. Da un lato questi agenti aiutano a minimizzare la contaminazione nelle cornee conservate, ma dall’altro possono impedire la crescita di alcuni microrganismi la cui presenza potrebbe non essere rivelata durante l’analisi microbiologica e, di conseguenza, potrebbero essere trasferiti al paziente trapiantato.

Questo è il motivo per cui il “Test di idoneità al metodo” della Farmacopea Europea (EP) raccomanda di rimuovere tutti i fattori che possono interferire con la crescita microbica prima del test microbiologico.

La stessa Banca degli Occhi di Monza era solita eseguire i test microbiologici utilizzando il sistema automatico BACTEC™ (Becton Dickinson), nel quale i campioni dei medium di conservazione vengono testati utilizzando specifici flaconi BACTEC™ contenenti resine che dovrebbero trattenere eventuali residui di antimicrobici. Nonostante l’uso di un sistema automatico, è stato dimostrato che a volte i risultati ottenuti possono essere fuorvianti.

Per evitare risultati falsamente negativi, il nuovo metodo studiato prevede una fase aggiuntiva in cui tutti i medium sono trattati prima del test con un dispositivo medico brevettato simile a una siringa, marcato CE, RESEP (Alchimia Srl), contenente una speciale miscela di resine per l’eliminazione totale degli antimicrobici dal medium di conservazione corneale.

Questo metodo è stato convalidato utilizzando sia campioni dei medium di organo-coltura (Tissue-C, Alchimia Srl) sia campioni del medium per la deturgescenza/trasporto (Carry-C, Alchimia Srl) inoculati con vari ceppi microbici indicati dalla Farmacopea Europea prima del trasferimento nelle bottiglie BACTEC™ per l’analisi automatica. Naturalmente, sono stati anche usati controlli negativi (cioè campioni senza ceppi microbici) e controlli positivi (cioè campioni con ceppi microbici).

I risultati ottenuti hanno mostrato che l’uso di RESEP ha aumentato la sensibilità del test di sterilità del sistema automatizzato BACTEC™ fino al 100% e, di conseguenza, ha consentito la convalida del metodo del test di sterilità dei medium per la conservazione corneale e per la deturgescenza/trasporto secondo i requisiti della Farmacopea Europea.

Riferimenti:

• Vignola R. et al. Validation of the BD BACTEC™ method for sterility testing of corneal preservation media according to the European Pharmacopoeia (chapter 2.6.1.). Presentations at the European Association of Tissue Banks EATB 2017 and 2018
• Vignola et al. A two-centre validation study of sterility test of corneal storage media with elimination of interfering antimicrobials in compliance with the European Pharmacopoeia. Cell Tissue Bank 2019 https://doi.org/10.1007/s10561-019-09766-7
• Council of Europe (2013a) Sterility test. In: European Directorate For The Quality of Medicines and Healthcare (ed) European Pharmacopoeia, Eight edn, Vol I, Strasbourg Cedex, France, pp 175–178
• Schroeter J. et al. Validation of the microbiological testing of tissue preparations using the BACTECTM blood culture system. Transfus Med Hemother 2012;39(6):387–390
• Mistò R. et al. Method for sterility testing of corneal storage and transport media after removal of interfering antimicrobials: prospective validation study in compliance with the European Pharmacopoeia. BMJ Open Ophthalmol 2017;2(1): e000093.

Recentemente è stato proposto di effettuare durante la chirurgica rimozione della membrana epiretinica (ERM) anche il peeling della membrana limitante interna (ILM) per ridurre al minimo le recidive, a condizione che il peeling venga effettuato molto delicatamente per ridurre al minimo pericolosi strappi della retina sottostante e successivi danni strutturali dell’occhio.

Durante le procedure di chirurgia vitreo retinica, la visualizzazione di strutture trasparenti come la corteccia vitreale, la ERM e la ILM può rappresentare una sfida; tuttavia, un’adeguata colorazione di questi tessuti può aumentare l’efficacia di una rimozione non traumatica.

La chirurgia vitreo retinica si è rapidamente evoluta negli ultimi 10 anni grazie allo sviluppo di nuove tecniche e al miglioramento delle macchine per la vitrectomia. Inoltre, un grande sforzo è stato fatto nella formulazione di coloranti vitali per migliorare la visualizzazione dei tessuti e facilitare il peeling delle membrane: questo ha portato ad una grande riduzione di complicanze quali rotture iatrogene, danni alla retina e, infine, ad un minore disagio postoperatorio per i pazienti.

Per garantire tutto questo, il colorante per il segmento posteriore dell’occhio deve soddisfare alcuni importanti requisiti. Prima di tutto, deve essere abbastanza denso da distendersi e diffondersi facilmente sulla membrana senza causare danni a causa del peso eccessivo. Inoltre, deve aderire e colorare selettivamente le membrane degli occhi del segmento posteriore e nel contempo, essendo solubile in acqua, deve essere facilmente lavabile dai tessuti alla fine dell’intervento. Infine, e soprattutto, il colorante vitale non deve essere tossico per i tessuti oculari.

Negli ultimi decenni è emerso con forza il tema della sicurezza dei coloranti vitali.

Ad esempio, il verde indocianina è stato abbandonato a causa dei problemi di tossicità in vitro e in vivo. Invece, le formulazioni a base di trypan blu appositamente realizzate per l’uso nella chirurgia del segmento posteriore dell’occhio sono ritenute sicure e sono attualmente ritenute all’unanimità lo standard di riferimento per la chirurgia ERM.

Nei nostri laboratori di ricerca, il metodo scelto per testare la sicurezza dei coloranti vitali per la chirurgia del segmento posteriore dell’occhio è sempre stato un test di citotossicità in vitro validato quantitativamente e qualitativamente con metodo per contatto diretto secondo le ISO 10993-5.

Questo tipo di test presenta i seguenti vantaggi:

• è altamente sensibile e in grado di rilevare anche una debole citotossicità;
• viene eseguito non solo sui fibroblasti di topo BALB 3T3 ma anche sulle linee cellulari derivate dalla retina umana ARPE-19: in questo modo, è possibile soddisfare le raccomandazioni delle norme ISO affermando che il metodo per testare la citotossicità in vitro di un prodotto per uso umano dovrebbe essere selezionato per rappresentare, per quanto possibile, la situazione in cui il prodotto deve essere utilizzato;
• sebbene durante l’intervento chirurgico il colorante debba rimanere a contatto con i tessuti oculari per un tempo molto breve (di solito pochi secondi), il test di citotossicità del prodotto in esame viene eseguito per un tempo di contatto fino a 24 ore.

Riferimenti:

• Mariotti C. et al. Negative staining of the vitreous with the use of vital dyes. Eur J Pharmacol 2018;28(1):117-118
• Iuliano L. et al. Idiopathic epiretinal membrane surgery: safety, efficacy and patient-related outcomes. Clin Ophthalmol 2019; 13:1253:1265
• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:en

Negli Stati Uniti d’America, le cornee dei donatori vengono conservate a basse temperature in liquidi che non contengono antimicotici e vengono processate per le nuove tecniche di chirurgia lamellare il più presto possibile dopo l’approvvigionamento dei tessuti; pertanto, se il paziente incorre in un’infezione postoperatoria, non resta altra opzione possibile che il trattamento del paziente stesso.

L’aumento dell’incidenza di infezioni fungine post-operatorie negli ultimi anni negli Stati Uniti potrebbe essere dovuto all’assenza di agenti antimicotici nei media per la conservazione a freddo o a una più facile infiltrazione di organismi infettivi negli spazi lamellari durante la processazione dei tessuti. In ogni caso, la possibilità di integrare i medium per la conservazione a freddo con agenti antimicotici sta attirando una crescente attenzione come possibile soluzione per aumentare la sicurezza dei riceventi.

Un recente studio di time-kill in vitro condotto dal team di Ricerca e Sviluppo Alchilife su un nuovo medium contenente Amfotericina B (2,5 µg/ml) destinato alla conservazione a freddo di cornee espiantate ne ha dimostrato l’efficacia antimicotica – nonostante la bassa temperatura – contro i ceppi fungini comunemente associati a cheratite ed endoftalmite, come ad esempio C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis.

Parallelamente agli studi di time-kill, è stata anche determinata la Concentrazione Minima Inibente (MIC) di Amfotericina B per questi ceppi di Candida. Usando le strisce Etest contenenti una concentrazione di Amfotericina B variabile da 0.002 a 32 µg/ml che sono state depositate su piastre di agar contenente ciascun ceppo di lievito per 24 e 48 ore, sono state individuate MIC comprese tra 0.25 e > 1 ug/ml.

Questi risultati hanno suggerito che le differenze nell’efficacia fungicida nei diversi ceppi possono corrispondere alla diversa suscettibilità all’Amfotericina B secondo le varie MIC; non meno importante, hanno anche confermato la buona efficacia antifungina dell’Amfotericina B nel nuovo prodotto per la conservazione a freddo delle cornee, poiché la concentrazione di 2,5 µg/ml è ben al di sopra dei valori delle MIC determinate nello studio.

	MIC (1 µg/ml)
C. Parapsilosis ATCC 90018	0,25-0,38
C. Albicans UCL	≥ 1
C. Albicans ATCC 10231	0,19-0,25
C. Glabrata BPEI	0,5
C. Albicans ATCC MYA 2876	0,25
C. Tropicalis ATCC 750	0,38
C. Albicans ATCC 90028	0,25

Riferimenti:

• Aldave AJ et al. Report of the Eye Bank Association of America medical advisory board subcommittee on fungal infection after corneal transplantation. Cornea 2013; 32:149–154
• Giurgola L. et al. Antimycotic efficacy and safety of a new cold corneal storage medium by time-kill and toxicity studies. Cornea 2019; 38(19):1413-1321.
• Fontana L. et al. Interface infectious keratitis after anterior and posterior lamellar keratoplasty. Clinical features and treatment strategies. A review. Br J Ophthalmol 2018; 0:1–8

Quando la visualizzazione della capsula anteriore è compromessa a causa di un riflesso rosso assente o insufficiente, come in caso di cataratta matura, cataratta corticale densa, cataratta subcapsulare posteriore densa o occhi con vitreopatia asteroide densa, esiste un certo rischio di lacerazione della capsula anteriore che si estende alla periferia, con successiva predisposizione alla rottura della capsula posteriore, alla perdita del vitreo e alla dislocazione posteriore del nucleo.

La colorazione della capsula anteriore con coloranti contenenti trypan blue (TB), eseguita per la prima volta da Melles et al. nel 1999, aiuta i chirurghi a completare la capsuloressi in queste situazioni difficili.

Una bassa concentrazione di colorante a base di trypan blue, come ad esempio 0.05%, può fornire una buona colorazione della capsula anteriore e la tossicità endoteliale è comunemente considerata trascurabile quando il colorante contenente trypan blue viene usato a bassa concentrazione.

Tuttavia, per garantire la massima sicurezza del paziente, la biocompatibilità deve essere sempre verificata e la determinazione della citotossicità è parte del processo di valutazione iniziale previsto dalla norma ISO.

La ricerca di metodi veramente affidabili per testare la biocompatibilità e la citotossicità è sempre stata una delle missioni principali di Alchilife. Questo è il motivo per cui il test di citotossicità in vitro con metodo per contatto diretto secondo ISO 10993-5, che è altamente sensibile e in grado di rilevare anche una debole citotossicità, è sempre stato il metodo di elezione utilizzato nei nostri laboratori di ricerca.

Utilizzando questo approccio, il dipartimento R&D di Alchimia ha convalidato quantitativamente e qualitativamente il test di citotossicità dei coloranti vitali del segmento anteriore secondo la norma ISO 10993-5. Utilizzando solo 30 µl di colorante applicato sulle linee cellulari ARPE19 e BALB 3T3 per 24 ore, l’assenza o la presenza di una qualche citotossicità in tutti i tipi di coloranti a base di trypan blue può essere facilmente e attendibilmente accertata.

Un aspetto dei metodi per testare la citotossicità adottati dalla nostra Ricerca e Sviluppo che merita particolare attenzione è quello di fornire “un’ulteriore garanzia” sulla sicurezza dei coloranti a base di trypan blue da utilizzare durante la chirurgia del segmento anteriore: è stato scelto di eseguire il test di citotossicità non solo sulla linea di fibroblasti murini BALB 3T3, ma anche sulla linea cellulare epiteliale del pigmento retinico umano ARPE19.

Questo è il nostro metodo per garantire che i coloranti a base di trypan blue siano sicuri anche in caso di colorazione involontaria del vitreo durante l’intervento chirurgico di cataratta – un evento che può verificarsi, sebbene non frequentemente, durante l’intervento chirurgico del segmento anteriore.

Riferimenti:

• Parkash et al. Modified 30 G needle trypan blue staining technique under air for a uniform and consistent anterior capsule staining. Clin Ophthalmol 2017; 11:1651-1659
• Melles GRI et al. Trypan blue capsule staining of visualize the capsulorhexis in cataract surgery. J Cataract Refract Surg 1999; 25:7-9
• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:en
• Coelho RP. Inadvertent vitreous staining by trypan blue during phacoemulsification. Vis Pan-Am 2016; 15:26-27.
• Gaur A. Inadvertent vitreous staining. J Cataract Refract Surg 2005; 31:649.

Le nuove tecniche di chirurgia lamellare della cornea per la sostituzione selettiva della parte di tessuto malato, che sono ad oggi preferite rispetto alla cheratoplastica perforante (trapianto dell’intera cornea) sono state correlate, almeno in parte, a un’aumentata incidenza di infezioni fungine postoperatorie negli Stati Uniti. Due sono i componenti suggeriti come fattori di rischio: in primo luogo, queste tecniche potrebbero facilitare l’infiltrazione di organismi infettivi nelle strutture lamellari e in secondo luogo, ma non meno importante, i medium per la conservazione a freddo comunemente usati negli Stati Uniti non contengono agenti antimicotici.

Recentemente, il nostro team di Ricerca e Sviluppo ha concluso gli studi per valutare l’efficacia fungicida in vitro di Kerasave contro varie specie di Candida comunemente associate a cheratiti ed endoftalmiti, come ad esempio C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis.

Kerasave, un nuovo medium sviluppato da Alchimia Srl (Italia) che viene fornito con una compressa di Amfotericina B da aggiungere al medium prima dell’uso (la cui concentrazione finale è quindi pari a 2,5 µg/ml) è destinato alla conservazione delle cornee espiantate a 4 °C per un massimo di 14 giorni.

Kerasave ha dimostrato di possedere un’elevata efficacia antifungina a 4 °C, in particolare contro Candida albicans e Candida tropicalis. Già entro 5 giorni dall’incubazione, in quattro dei sei campioni contaminati con 10 unità formanti colonie (CFU)/ml di ceppi è stata notata una riduzione media della contaminazione fungina ≥ 3 Log10 rispetto ai controlli (p <0,01).

L’utilità di aggiungere un agente antimicotico al medium per la conservazione a freddo è ancora oggetto di dibattito negli Stati Uniti, principalmente a causa di alcune preoccupazioni sul rapporto efficacia/sicurezza. I risultati di questo studio possono aiutare a dissipare tutti questi dubbi, in quanto:

• per ottenere risultati veramente affidabili sull’efficacia antimicotica, tutti i campioni liquidi prima del piastramento sono stati trattati con RESEP (Alchimia Srl), un dispositivo brevettato simile a una siringa, marcato CE, contenente una miscela di resine per la rimozione di eventuali residui antimicrobici dai campioni per evitare risultati falsi-negativi durante i test microbiologici;
• l’assenza di fenomeni di citotossicità, irritazione o sensibilizzazione di Kerasave è stata valutata mediante test di citotossicità in vitro e di irritazione oculare e di ipersensibilità ritardata in vivo eseguiti secondo le normative ISO 10993-5 e 10993-10.

Inoltre, va ricordato che negli Stati Uniti solitamente il trapianto del tessuto oculare viene eseguito il più presto possibile subito dopo il recupero dal donatore: ciò rende impossibile completare i test microbiologici prima dell’intervento chirurgico e, quindi, in caso di infezione postoperatoria, non resta altra opzione possibile che il trattamento del paziente operato.

Pertanto, i risultati degli studi di time-kill aggiungono altri dati a favore della sicurezza di Kerasave e dell’efficacia e della sicurezza riguardo l’aggiunta di Amfotericina B ad un medium per la conservazione della cornea a freddo.

Riferimenti:

• Giurgola l. et al. Antimycotic efficacy and safety of a new cold corneal storage medium by time-kill and toxicity studies. Cornea 2019, July 22, publish ahead of print.Skenderi Z. et al.
• Increased sensitivity of microbiological testing of cornea organ culture medium by additional resin treatment.BMJ Open Ophthalmol. 2018;3: e000173
• Fontana L. et al. Interface infectious keratitis after anterior and posterior lamellar keratoplasty. Clinical features and treatment strategies. A review. Br J Ophthalmol. 2018; 0:1–8.
• ISO 10993-5:2009 biological evaluation of medical devices part 5: tests for in vitro cytotoxicity. Available at: https://www.iso.org/obp/ui/ #iso:std:iso:10993:-5:en. Accessed July 6, 2019.
• ISO 10993-10:2010 biological evaluation of medical devices part 10: tests for irritation and skin sensitization. August 1, 2018. Available at: https://www.iso.org/obp/ui/”\l”iso:std:iso:10993:-10:ed-3:v1:en. Ac- cessed July 6, 2019