Recentemente è stato proposto di effettuare durante la chirurgica rimozione della membrana epiretinica (ERM) anche il peeling della membrana limitante interna (ILM) per ridurre al minimo le recidive, a condizione che il peeling venga effettuato molto delicatamente per ridurre al minimo pericolosi strappi della retina sottostante e successivi danni strutturali dell’occhio.

Durante le procedure di chirurgia vitreo retinica, la visualizzazione di strutture trasparenti come la corteccia vitreale, la ERM e la ILM può rappresentare una sfida; tuttavia, un’adeguata colorazione di questi tessuti può aumentare l’efficacia di una rimozione non traumatica.

La chirurgia vitreo retinica si è rapidamente evoluta negli ultimi 10 anni grazie allo sviluppo di nuove tecniche e al miglioramento delle macchine per la vitrectomia. Inoltre, un grande sforzo è stato fatto nella formulazione di coloranti vitali per migliorare la visualizzazione dei tessuti e facilitare il peeling delle membrane: questo ha portato ad una grande riduzione di complicanze quali rotture iatrogene, danni alla retina e, infine, ad un minore disagio postoperatorio per i pazienti.

Per garantire tutto questo, il colorante per il segmento posteriore dell’occhio deve soddisfare alcuni importanti requisiti. Prima di tutto, deve essere abbastanza denso da distendersi e diffondersi facilmente sulla membrana senza causare danni a causa del peso eccessivo. Inoltre, deve aderire e colorare selettivamente le membrane degli occhi del segmento posteriore e nel contempo, essendo solubile in acqua, deve essere facilmente lavabile dai tessuti alla fine dell’intervento. Infine, e soprattutto, il colorante vitale non deve essere tossico per i tessuti oculari.

Negli ultimi decenni è emerso con forza il tema della sicurezza dei coloranti vitali.

Ad esempio, il verde indocianina è stato abbandonato a causa dei problemi di tossicità in vitro e in vivo. Invece, le formulazioni a base di trypan blu appositamente realizzate per l’uso nella chirurgia del segmento posteriore dell’occhio sono ritenute sicure e sono attualmente ritenute all’unanimità lo standard di riferimento per la chirurgia ERM.

Nei nostri laboratori di ricerca, il metodo scelto per testare la sicurezza dei coloranti vitali per la chirurgia del segmento posteriore dell’occhio è sempre stato un test di citotossicità in vitro validato quantitativamente e qualitativamente con metodo per contatto diretto secondo le ISO 10993-5.

Questo tipo di test presenta i seguenti vantaggi:

• è altamente sensibile e in grado di rilevare anche una debole citotossicità;
• viene eseguito non solo sui fibroblasti di topo BALB 3T3 ma anche sulle linee cellulari derivate dalla retina umana ARPE-19: in questo modo, è possibile soddisfare le raccomandazioni delle norme ISO affermando che il metodo per testare la citotossicità in vitro di un prodotto per uso umano dovrebbe essere selezionato per rappresentare, per quanto possibile, la situazione in cui il prodotto deve essere utilizzato;
• sebbene durante l’intervento chirurgico il colorante debba rimanere a contatto con i tessuti oculari per un tempo molto breve (di solito pochi secondi), il test di citotossicità del prodotto in esame viene eseguito per un tempo di contatto fino a 24 ore.

Riferimenti:

• Mariotti C. et al. Negative staining of the vitreous with the use of vital dyes. Eur J Pharmacol 2018;28(1):117-118
• Iuliano L. et al. Idiopathic epiretinal membrane surgery: safety, efficacy and patient-related outcomes. Clin Ophthalmol 2019; 13:1253:1265
• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:en

Negli Stati Uniti d’America, le cornee dei donatori vengono conservate a basse temperature in liquidi che non contengono antimicotici e vengono processate per le nuove tecniche di chirurgia lamellare il più presto possibile dopo l’approvvigionamento dei tessuti; pertanto, se il paziente incorre in un’infezione postoperatoria, non resta altra opzione possibile che il trattamento del paziente stesso.

L’aumento dell’incidenza di infezioni fungine post-operatorie negli ultimi anni negli Stati Uniti potrebbe essere dovuto all’assenza di agenti antimicotici nei media per la conservazione a freddo o a una più facile infiltrazione di organismi infettivi negli spazi lamellari durante la processazione dei tessuti. In ogni caso, la possibilità di integrare i medium per la conservazione a freddo con agenti antimicotici sta attirando una crescente attenzione come possibile soluzione per aumentare la sicurezza dei riceventi.

Un recente studio di time-kill in vitro condotto dal team di Ricerca e Sviluppo Alchilife su un nuovo medium contenente Amfotericina B (2,5 µg/ml) destinato alla conservazione a freddo di cornee espiantate ne ha dimostrato l’efficacia antimicotica – nonostante la bassa temperatura – contro i ceppi fungini comunemente associati a cheratite ed endoftalmite, come ad esempio C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis.

Parallelamente agli studi di time-kill, è stata anche determinata la Concentrazione Minima Inibente (MIC) di Amfotericina B per questi ceppi di Candida. Usando le strisce Etest contenenti una concentrazione di Amfotericina B variabile da 0.002 a 32 µg/ml che sono state depositate su piastre di agar contenente ciascun ceppo di lievito per 24 e 48 ore, sono state individuate MIC comprese tra 0.25 e > 1 ug/ml.

Questi risultati hanno suggerito che le differenze nell’efficacia fungicida nei diversi ceppi possono corrispondere alla diversa suscettibilità all’Amfotericina B secondo le varie MIC; non meno importante, hanno anche confermato la buona efficacia antifungina dell’Amfotericina B nel nuovo prodotto per la conservazione a freddo delle cornee, poiché la concentrazione di 2,5 µg/ml è ben al di sopra dei valori delle MIC determinate nello studio.

	MIC (1 µg/ml)
C. Parapsilosis ATCC 90018	0,25-0,38
C. Albicans UCL	≥ 1
C. Albicans ATCC 10231	0,19-0,25
C. Glabrata BPEI	0,5
C. Albicans ATCC MYA 2876	0,25
C. Tropicalis ATCC 750	0,38
C. Albicans ATCC 90028	0,25

Riferimenti:

• Aldave AJ et al. Report of the Eye Bank Association of America medical advisory board subcommittee on fungal infection after corneal transplantation. Cornea 2013; 32:149–154
• Giurgola L. et al. Antimycotic efficacy and safety of a new cold corneal storage medium by time-kill and toxicity studies. Cornea 2019; 38(19):1413-1321.
• Fontana L. et al. Interface infectious keratitis after anterior and posterior lamellar keratoplasty. Clinical features and treatment strategies. A review. Br J Ophthalmol 2018; 0:1–8

Le nuove tecniche di chirurgia lamellare della cornea per la sostituzione selettiva della parte di tessuto malato, che sono ad oggi preferite rispetto alla cheratoplastica perforante (trapianto dell’intera cornea) sono state correlate, almeno in parte, a un’aumentata incidenza di infezioni fungine postoperatorie negli Stati Uniti. Due sono i componenti suggeriti come fattori di rischio: in primo luogo, queste tecniche potrebbero facilitare l’infiltrazione di organismi infettivi nelle strutture lamellari e in secondo luogo, ma non meno importante, i medium per la conservazione a freddo comunemente usati negli Stati Uniti non contengono agenti antimicotici.

Recentemente, il nostro team di Ricerca e Sviluppo ha concluso gli studi per valutare l’efficacia fungicida in vitro di Kerasave contro varie specie di Candida comunemente associate a cheratiti ed endoftalmiti, come ad esempio C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis.

Kerasave, un nuovo medium sviluppato da Alchimia Srl (Italia) che viene fornito con una compressa di Amfotericina B da aggiungere al medium prima dell’uso (la cui concentrazione finale è quindi pari a 2,5 µg/ml) è destinato alla conservazione delle cornee espiantate a 4 °C per un massimo di 14 giorni.

Kerasave ha dimostrato di possedere un’elevata efficacia antifungina a 4 °C, in particolare contro Candida albicans e Candida tropicalis. Già entro 5 giorni dall’incubazione, in quattro dei sei campioni contaminati con 10 unità formanti colonie (CFU)/ml di ceppi è stata notata una riduzione media della contaminazione fungina ≥ 3 Log10 rispetto ai controlli (p <0,01).

L’utilità di aggiungere un agente antimicotico al medium per la conservazione a freddo è ancora oggetto di dibattito negli Stati Uniti, principalmente a causa di alcune preoccupazioni sul rapporto efficacia/sicurezza. I risultati di questo studio possono aiutare a dissipare tutti questi dubbi, in quanto:

• per ottenere risultati veramente affidabili sull’efficacia antimicotica, tutti i campioni liquidi prima del piastramento sono stati trattati con RESEP (Alchimia Srl), un dispositivo brevettato simile a una siringa, marcato CE, contenente una miscela di resine per la rimozione di eventuali residui antimicrobici dai campioni per evitare risultati falsi-negativi durante i test microbiologici;
• l’assenza di fenomeni di citotossicità, irritazione o sensibilizzazione di Kerasave è stata valutata mediante test di citotossicità in vitro e di irritazione oculare e di ipersensibilità ritardata in vivo eseguiti secondo le normative ISO 10993-5 e 10993-10.

Inoltre, va ricordato che negli Stati Uniti solitamente il trapianto del tessuto oculare viene eseguito il più presto possibile subito dopo il recupero dal donatore: ciò rende impossibile completare i test microbiologici prima dell’intervento chirurgico e, quindi, in caso di infezione postoperatoria, non resta altra opzione possibile che il trattamento del paziente operato.

Pertanto, i risultati degli studi di time-kill aggiungono altri dati a favore della sicurezza di Kerasave e dell’efficacia e della sicurezza riguardo l’aggiunta di Amfotericina B ad un medium per la conservazione della cornea a freddo.

Riferimenti:

• Giurgola l. et al. Antimycotic efficacy and safety of a new cold corneal storage medium by time-kill and toxicity studies. Cornea 2019, July 22, publish ahead of print.Skenderi Z. et al.
• Increased sensitivity of microbiological testing of cornea organ culture medium by additional resin treatment.BMJ Open Ophthalmol. 2018;3: e000173
• Fontana L. et al. Interface infectious keratitis after anterior and posterior lamellar keratoplasty. Clinical features and treatment strategies. A review. Br J Ophthalmol. 2018; 0:1–8.
• ISO 10993-5:2009 biological evaluation of medical devices part 5: tests for in vitro cytotoxicity. Available at: https://www.iso.org/obp/ui/ #iso:std:iso:10993:-5:en. Accessed July 6, 2019.
• ISO 10993-10:2010 biological evaluation of medical devices part 10: tests for irritation and skin sensitization. August 1, 2018. Available at: https://www.iso.org/obp/ui/”\l”iso:std:iso:10993:-10:ed-3:v1:en. Ac- cessed July 6, 2019

Il team di Ricerca e Sviluppo Alchilife, in collaborazione con il dott. Mario Romano, è uno dei primi laboratori ad avere convalidato un metodo per contatto diretto per l’effettuazione del test di citotossicità secondo gli standard ISO 10993-5 sui perfluorocarburi liquidi (PFCL) utilizzati in chirurgia oftalmica.

La selezione di un metodo veramente affidabile per la valutazione della citotossicità dei perfluorocarburi è la strategia chiave per evitare serie preoccupazioni sulla sicurezza dei pazienti. I tristi episodi accaduti negli ultimi anni hanno dimostrato che il “saggio previa estrazione”, nonostante sia menzionato tra i test previsti dalle normative ISO 10993-5, non è un test affidabile per i dispositivi medici contenenti sostanze volatili. Al contrario, grazie all’elevata sensibilità, il test per contatto diretto – che è sempre stato il metodo di elezione utilizzato nei laboratori Alchilife, è in grado di rilevare anche bassi livelli di citotossicità: di fatto, c’è un interesse crescente per questo tipo di test nel campo della sicurezza dei perfluorocarburi.

Sfruttando l’alta densità dei perfluorocarburi liquidi, il team di ricercatori Alchilife ha potuto garantire l’effettivo contatto diretto tra il perfluorocarburo in esame e il substrato cellulare (ovvero lo strato di cellule ARPE-19 e BALB 3T3) per l’intera durata del test. Ciò avviene immergendo la punta della pistola pipettatrice nel medium proprio sopra le linee cellulari e depositando lentamente il perfluorocarburo liquido: si crea così una “bolla” densa che si appoggia delicatamente sulle cellule a causa della forza di gravità, evitando nel contempo che la pesantezza del campione eserciti una pressione eccessiva sullo strato cellulare. Questi passaggi riproducono quanto avviene all’interno dell’occhio durante l’uso clinico. La bolla densa, così formata, evita l’evaporazione del campione o la perdita di contatto del perfluorocarburo con le cellule. Con questo metodo si supera il problema dell’insolubilità del PFCL in acqua che impedisce la diluizione del campione nel medium – fattore in grado di compromettere l’affidabilità del “saggio previa estrazione” per testare la citotossicità del perfluorocarburo.

Con l’approccio utilizzato da Alchilife è possibile testare con successo varie aree e tempi di contatto (fino a 24 ore). Come risultato di questo studio, i cui risultati preliminari sono stati presentati dal dott. Romano al 18° Congresso Euretina a Vienna, è stato convalidato quantitativamente e qualitativamente su ARPE-19 e BALB 3T3 un test di citotossicità per contatto diretto dei perfluorocarburi che garantisce la copertura del 59% delle superfici cellulari e il contatto con queste per 24 ore, come raccomandato nella ISO 10993-5.

Riferimenti:

• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.
  https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:en (accessed 20 July 2019)
• Li et al. Study on the in vitro cytotoxicity testing of medical devices(Review). Biomed Rep 2015;3(5):617-620.
• Srivastava GK et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxity evaluation. Sci Rep 2018;8(1):1425.
• Romano M. Perfluorocarbons for intraocular use: cytotoxicity test validation according to the ISO 10993-5. Presentation at Euretina 2018
• Romano MR et al. Evaluation of Cytotoxicity of Perfluorocarbons for Intraocular Use by Cytotoxicity Test In Vitro in Cell Lines and Human Donor Retina Ex Vivo. Transl Vis Sci Technol 2019; 8(5):24.

Il team di Ricerca e Sviluppo Alchilife è impegnato nella messa a punto di test di citotossicità veramente affidabili eseguiti secondo lo standard ISO 10993-5 sui dispositivi medici per la chirurgia oftalmica come i perfluorocarburi liquidi, coloranti per la chirurgia del segmento anteriore e posteriore e oli di silicone.

I gravi episodi di tossicità oculari avvenuti negli ultimi anni in Spagna in seguito all’utilizzo di alcuni perfluorocarburi in commercio ci ha insegnato che anche i composti ad alta purezza possono destare serie preoccupazioni per quanto riguarda la sicurezza dei pazienti, poiché è stato dimostrato che la presenza di minime quantità di impurità possono essere responsabili di fenomeni di citotossicità.

Nei nostri laboratori, il “metodo per contatto diretto” descritto nello standard ISO 10993-5 è sempre stato il test di elezione – eseguito con un approccio quantitativo e qualitativo sulle linee cellulari ARPE-19 e BALB/3T3 – per determinare il possibile rischio tossicologico di un prodotto. Tuttavia, i recenti eventi hanno spinto i nostri ricercatori a effettuare una ancor più accurata revisione dello standard ISO 10993-5 al fine di perfezionare e convalidare dei test di citotossicità veramente affidabili, in grado verificare con la massima accuratezza la sicurezza di una vasta gamma di dispositivi medici per uso intraoculare.

Se eseguiti su prodotti già disponibili in commercio, questi test serviranno come valutazione della sicurezza post-market; se eseguiti su materie prime e prodotti in fase di sviluppo, saranno utili strumenti di screening prima di eseguire test tossicologici più dettagliati.

Riferimenti:

• Pastor et al. Acute retinal damage after using a toxic perfluoro-octane for vitreo-retinal surgery. Retina 2017;37(6):1140-1151.
• Li et al. Study on the in vitro cytotoxicity testing of medical devices(Review). Biomed Rep 2015;3(5):617-620.
• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.
  https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:en (accessed 16 July 2019)
• Romano M. Cytotoxicity testing according to ISO 10993-5 of perfluorocarbon manufacturing process residuals. Presentation at Euretina 2018
• Romano MR et al. Evaluation of Cytotoxicity of Perfluorocarbons for Intraocular Use by Cytotoxicity Test In Vitro in Cell Lines and Human Donor Retina Ex Vivo. Transl Vis Sci Technol 2019; 8(5):24